干貨分享 | 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇避坑指南！
細(xì)胞培養(yǎng)是生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中離不開的實(shí)驗(yàn)之***，它有廣泛的應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)可以用于研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、合成代謝、生長(zhǎng)增殖等。細(xì)胞培養(yǎng)的常見實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代和細(xì)胞凍存等，其中細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的過程對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)有重要影響。
局部電解質(zhì)濃度改變，pH值改變，部分蛋白質(zhì)變性；
細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，可引起溶酶體的損傷使溶解酶釋放，造成細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分的破壞、線粒體腫脹、功能喪失并造成細(xì)胞能量代謝障礙；
細(xì)胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起膜通透性改變，使細(xì)胞內(nèi)容物喪失；
細(xì)胞核在冷凍保存時(shí)也易受損。
為了降低在細(xì)胞凍存時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷，可以在凍存時(shí)加入凍存保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）（SKU：02196055）以降低對(duì)細(xì)胞損傷或死亡。DMSO作為滲透性細(xì)胞保護(hù)劑，其能夠迅速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，防止細(xì)胞內(nèi)液冰晶的形成，以及防止細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等。
二甲基亞砜（DMSO）結(jié)構(gòu)式
研究表明，不同濃度的DMSO對(duì)細(xì)胞活力均有影響，DMSO濃度不超過10%時(shí)，對(duì)細(xì)胞的活力影響較小（如圖1）。除此之外，DMSO濃度為10%時(shí)，抑菌效果能夠接近***。在DMSO中加入適宜濃度的血清，有助于解凍后提高細(xì)胞收獲率和其功能活性的恢復(fù)。因此，細(xì)胞凍存時(shí)常常使用10%濃度的DMSO，可以在其中加入胎牛血清等作為保護(hù)劑，血清有助于解凍后細(xì)胞功能活性的恢復(fù)（如圖2為細(xì)胞凍存流程圖）。
圖1. DMSO濃度與細(xì)胞活力[1]
圖2. 細(xì)胞凍存操作流程圖
細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或低溫冰箱中的細(xì)胞解凍后重新培養(yǎng)，使其恢復(fù)生長(zhǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇過程中，需要遵循快速融化的原則，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶短時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)再形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。細(xì)胞復(fù)蘇后1-2天，細(xì)胞活性會(huì)逐漸得到恢復(fù)（如圖3為復(fù)蘇HEK293T細(xì)胞數(shù)對(duì)數(shù)值）。 細(xì)胞復(fù)蘇的主要實(shí)驗(yàn)過程如下： 步驟1：從液氮容器或低溫冰箱中取出凍存管，迅速將其浸入37℃的溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)以使其盡快融化。37℃水浴時(shí)間盡可能短（1-2min），因?yàn)檠娱L(zhǎng)時(shí)間會(huì)增加細(xì)胞死亡率； 步驟2：當(dāng)細(xì)胞完全融化后，從水浴中取出凍存管，用酒精棉球消毒外部，然后開啟瓶蓋； 步驟3：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入適量的培養(yǎng)液，并進(jìn)行離心，以去除DMSO和死細(xì)胞； 步驟4：離心后，棄去上清液，用新的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度； 步驟5：將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中， 37℃靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，應(yīng)注意觀察細(xì)胞狀態(tài)，以確保其正常生長(zhǎng)。 圖3. HEK-293T細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（復(fù)蘇后）[2] 圖4. 細(xì)胞復(fù)蘇操作流程圖
細(xì)胞凍存及復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)常見的實(shí)驗(yàn)方法，選擇合適的方法以及合理的操作能夠保證細(xì)胞的活性。除此之外，選擇合適的凍存保護(hù)劑也是該實(shí)驗(yàn)中較為關(guān)鍵的***步，例如DMSO應(yīng)當(dāng)選擇內(nèi)毒素水平低、細(xì)胞培養(yǎng)***的產(chǎn)品，能夠降低對(duì)細(xì)胞的損傷。a
(文章來源于儀器網(wǎng))
