基于 AI 的人胰腺癌類(lèi)器官藥物篩選策略
簡(jiǎn) 介 癌癥仍然是 21 世紀(jì)的主要死因之***，雖然腫瘤學(xué)方面取得了***新進(jìn)展，但大多數(shù)癌癥患者仍缺乏持久的個(gè)性化治療方案，只能通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗癌化合物及其組合物的影響。目前患者來(lái)源的器官樣本 (PDOs) 表現(xiàn)出長(zhǎng)期擴(kuò)展?jié)摿Γ瑫r(shí)也保留腫瘤組織病理學(xué)以及癌癥基因突變，可作為離體測(cè)試可行、有效的模型。但是到目前為止，類(lèi)器官樣品因均質(zhì)性差、操作困難、自動(dòng)化方案不理想而使 PDOs 在藥物篩選應(yīng)用中受到了限制。此外，器官樣本在培養(yǎng)基中的隨機(jī)分布，也使得類(lèi)器官的成像和圖像分析變得復(fù)雜。 為克服這些挑戰(zhàn)，我們使用 Gri3D 平臺(tái) (SUN bioscience) 建立了 PDOs 化合物篩選工作流程，該平臺(tái)由具有適合高通量和可重復(fù)類(lèi)器官培養(yǎng)的微腔板組成。基于標(biāo)準(zhǔn) 96 孔微孔板，每個(gè)孔內(nèi)都含有***個(gè)抗細(xì)胞粘附的水凝膠微孔。在 Gri3D 上，類(lèi)器官可在微孔中位于同***成像平面且穩(wěn)定生長(zhǎng)。這極大地促進(jìn)了基于圖像篩選的高內(nèi)涵 3D 圖像采集和定量分析。此外，該移液口可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)細(xì)胞接種、培養(yǎng)基交換和化合物孵育等實(shí)驗(yàn)操作，從而提高檢測(cè)的可重復(fù)性。 在這項(xiàng)研究中，我們將人胰腺癌 PDOs 暴露于***系列不同劑量的抗癌化合物中，并使用活性染料 Calcein AM ( 活染 ) 和 Ethidium Homodimer-1 ( 死染 ) 進(jìn)行染色，通過(guò)高內(nèi)涵共聚焦成像測(cè)試 PDOs 對(duì)藥物的反應(yīng)。使用基于 AI 的方法，我們高效地檢測(cè)到每個(gè)類(lèi)器官樣品，并從三個(gè)通道 ( 明場(chǎng)、活細(xì)胞染色和死細(xì)胞染色 ) 中提取與細(xì)胞毒性相關(guān)表型特征。***先通過(guò) PCA 或 UMAP，將提取樣品尺寸特征 ( 超過(guò) 100 個(gè) ) 減少到 3 個(gè)組分。然后，利用機(jī)器學(xué)習(xí)在 3D 散點(diǎn)圖中可視化、排序和聚類(lèi)處理。數(shù)據(jù)表明，50μM Palbociclib 具有與陽(yáng)性對(duì)照相似的顯著細(xì)胞毒性作用，這與傳統(tǒng)的活 / 死細(xì)胞分析結(jié)果***致，證明了使用 AI 驅(qū)動(dòng)對(duì)藥物篩選進(jìn)行可靠、公正的數(shù)析方法的可行性。
實(shí)驗(yàn)室耗材和儀器 Gri3D 是***個(gè)用于高通量和可重復(fù)類(lèi)器官培養(yǎng)的即用型平臺(tái)。基于孔內(nèi)水凝膠形成的***系列超密集 U 形底微孔，使每個(gè)微腔中均能生成單個(gè)類(lèi)器官，并在無(wú)固體 ECM 的懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。 我們使用配備轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦和 sCMOS 相機(jī)的 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)可捕獲整個(gè)類(lèi)器官的 3D 結(jié)構(gòu)。
方法 在 96 孔 Gri3D 500 μm 孔徑的微孔塑料板中培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化胰腺癌類(lèi)器官，并用抗癌藥物處理其 72 小時(shí)。利用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng) (Molecular Devices ) 的透射光 (TL) 對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)類(lèi)器官進(jìn)行連續(xù)拍攝，而后對(duì)類(lèi)器官進(jìn)行活 / 死測(cè)定。通過(guò) IN Carta 圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析 ( 圖 1 )。分析中，對(duì)每孔 40 個(gè)類(lèi)器官進(jìn)行圖像分割，并從每個(gè)類(lèi)器官中提取 50 多個(gè)指標(biāo)。***后，利用 StratoMineR 數(shù)據(jù)分析軟件 (Core Life Analytics)對(duì)每個(gè)類(lèi)器官相關(guān)的特征進(jìn)行分析。 圖 1 類(lèi)器官藥物處理工作流程示意圖。該工作流程結(jié)合了 Gri3D、高內(nèi)涵成像系統(tǒng)以及人工智能的圖像分析軟件 (Molecular Devices )
化合物的表型效應(yīng) 在 Palbociclib 暴露后，細(xì)胞死活的分析中顯示類(lèi)器官的存活率隨著藥物濃度的增加而下降，而在 trametinib 處理的類(lèi)器官中未觀察明顯現(xiàn)象 ( 圖 2B )。這種基于深度學(xué)習(xí)的 TL 圖像分析方法，可以有效地檢測(cè)到單個(gè)類(lèi)器官隨時(shí)間變化的參數(shù)。此外，灰度非正態(tài)因子 (GLNN) 可作為類(lèi)器官灰度值測(cè)試指標(biāo)。如圖 2C 所示，這個(gè)值隨著 Palbociclib 和 Trametinib 劑量的增加而降低 ( 見(jiàn)圖 2C )，這些藥物會(huì)引起類(lèi)器官的生長(zhǎng)缺陷。 圖 2 抗癌化合物暴露人胰腺癌 PDOs 72 小時(shí)結(jié)果。A. TL 圖像在曝光前 ( 0 小時(shí) ) 和曝光后 ( 72 小時(shí) ) 以及活 / 死 (Live/Dead) 實(shí)驗(yàn)后的類(lèi)器官的***大投影圖像。綠色：Calcein AM，活細(xì)胞；紅色：EthD-1，死細(xì)胞。B.Ethidium homodimer-1 (EthD-1) 與 Calcein AM 強(qiáng)度比。C. TL 圖像的灰度非正態(tài)因子(GLNN) 變化。誤差顯示標(biāo)準(zhǔn)差。每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)類(lèi)器官。單因素方差分析 Dunnett 多重比較，**P<0,01，P****<0.0001，ns：不顯著。比例尺：250μm。
通過(guò)參數(shù)降維選擇合適條件 IN Carta 數(shù)據(jù)分析軟件提取了 TL、EthD-1 和 Calcein AM 通道中每個(gè)類(lèi)器官相關(guān)的數(shù)百個(gè)特征參數(shù)。為了對(duì)藥物孔和對(duì)照孔進(jìn)行可視化和聚集分析，我們***先通過(guò)主要成分分析法將參數(shù)降維至三個(gè)組分，即 PCA01, PCA02 和 PCA03。然后，我們?cè)?3D 散點(diǎn)圖中對(duì)藥物孔和對(duì)照孔進(jìn)行可視化，其中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別形成其自己的簇 ( 圖 3 )，藥物中 50 uM Palbocilib 是唯******個(gè)聚類(lèi)更接近陽(yáng)性對(duì)照的處理組 ( 圖 3 )，這個(gè)觀察結(jié)果與活 / 死細(xì)胞的結(jié)果分析***致 ( 圖 2 )。此外，從各藥物組 (Chebyshev ***大距離 ) 與平均陰性對(duì)照的排列中顯示，50 uM Palbociclib 排在***位，而四個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔排名前六。從這些結(jié)果表明，50 uM Palbociclib 對(duì)人胰腺癌類(lèi)器官的效應(yīng)***為明顯。 圖 3 通過(guò)主要成分分析進(jìn)行聚類(lèi)和排序。A.、B.、C. 與原始功能有加權(quán)關(guān)聯(lián)的三個(gè) PCA 組分。D. 三種 PCA 成分的 3D 散點(diǎn)圖。E. 藥物組、對(duì)照組與平均陰性對(duì)照的 Chebyshev ***大距離排序。
UMAP 為了驗(yàn)證我們的分析，我們使用統(tǒng)***流形逼近與投影法 (UMAP) 減少特征參數(shù)的維度情況。考慮到所有特征，聚類(lèi)圖也顯示了聚類(lèi)接近陽(yáng)性對(duì)照的 50 uM Palbociclib 處理組。為確定我們是否能夠僅用明場(chǎng)圖像區(qū)分表型變化，我們僅使用 TL 通道的特征進(jìn)行分析，但是所得的 3D 散點(diǎn)圖顯示沒(méi)有明顯的聚類(lèi)特征，這表明需要添加其他的特征進(jìn)行聚類(lèi)。 圖 4 UMAP 降維和聚類(lèi)。A. 所有特征的 UMAP 組份的 3D 散點(diǎn)圖。B. 僅 TL 通道特征的 UMAP 組份的 3D 散點(diǎn)圖。
概要 Gri3D 是***個(gè)用于高通量和可重復(fù)類(lèi)器官培養(yǎng)的平臺(tái)。 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)可捕獲高通量和高分辨率的類(lèi)器官 3D 結(jié)構(gòu)。 IN Carta 圖像分析軟件為每個(gè)類(lèi)器官生成 mask，并測(cè)量與每個(gè)類(lèi)器官相關(guān)的數(shù)百個(gè)特征參數(shù)。 StratoMineR 數(shù)據(jù)分析軟件利用人工智能對(duì)每種藥物處理進(jìn)行聚類(lèi)和排列分析。
(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))
